Pagkatapos ng 25 araw ng static incubation sa 28°C, ang laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC620 ay nagpakita ng pinakamataas na aktibidad sa fungal culture medium. Ang pinakamainam na pH at temperatura para sa enzyme na ito ay 3.0 at 70°C, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ng 2 oras ng incubation sa 40°C at 50°C, ang aktibidad ng enzyme ay nanatili sa 68.33% at 59.61%, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ng 2 oras ng incubation sa citrate-phosphate buffer (pH 7.0), ang aktibidad ng enzyme ay nanatili sa 100%. Ang pagdaragdag ng 10 mM MgSO₄ at CuSO₄ ay nagpataas sa aktibidad ng enzyme ng humigit-kumulang 21% at 35%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang NaCl, MnCl₂, KCl, at CaCl₂ ay pumigil sa aktibidad ng enzyme. Gamit ang ABTS bilang substrate, ang mga kinetic parameter (Km at Vmax) ng *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase ay 1.99 mM at 16,217 μmol min−1 L−1, ayon sa pagkakabanggit. Ang enzymatic treatment ng mga sample ng apple juice ay makabuluhang nagbawas sa parehong pH at viscosity, at ang pagbawas na ito ay may kaugnayan sa pagtaas ng oras ng pag-iimbak. Ang paggamot gamit ang laccase ay nagresulta sa bahagyang pagbaba sa kabuuang phenolic content ng apple juice, ngunit walang naobserbahang pagbawas sa antioxidant activity.
Sa mga nakaraang taon, nakatuon ang mga mananaliksik sa aplikasyon ng berdeng biotechnology sa industriya ng pagkain. Ang Laccase ay isa sa mga pinakakapaki-pakinabang na enzyme sa industriya ng pagkain, na nakakahanap ng mga aplikasyon sa mga larangan tulad ng pagproseso ng juice, pagbe-bake, pagpapatatag ng alak, at pagpapabuti ng mga organoleptikong katangian ng mga produktong pagkain.1Maraming mas matataas na halaman at mikroorganismo ang naglalabas ng laccase,2at ang mga fungi tulad ng deuteromycetes, ascomycetes, at basidiomycetes ay maaari ring makagawa ng laccase.3Ang Laccase (EC 1.10.3.2) ay isang blue oxidase na nagbabawas ng molecular oxygen tungo sa tubig gamit ang isang sistemang binubuo ng tatlong magkakaibang atomo ng tanso, sa gayon ay nag-o-oxidize ng iba't ibang phenolic compound at aromatic amines. Sa panahon ng paggawa ng mga katas ng prutas at gulay, ang enzymatic at nonenzymatic browning ay mga kritikal na isyu.4Dahil ang mga sangkap na ito ay negatibong nakakaapekto sa kulay, lasa, at aroma ng juice, dapat itong alisin.5
Sa lahat ng prutas, ang mansanas ang pinakamadalas na kinokonsumo sa buong mundo at sa European Union. Noong 2019, ang produksyon ng mansanas ay pumangatlo sa buong mundo, na lumampas sa 87 milyong tonelada.6Ang mga mansanas ay nagtataglay ng maraming phenolic compounds, kabilang ang mga flavonoid at phenolic acids tulad ng caffeic acid at chlorogenic acid.7Dahil ang katas ng mansanas ay karaniwang iniinom sa malinaw na anyo nito, humigit-kumulang 50% hanggang 90% ng mga phenolic na sangkap ang nawawala sa proseso ng pagsasala.8Sa kasalukuyan, ang mga mamimili ay may tendensiyang pumili ng mga produktong minimally processed, tulad ng cloudy apple juice na may mataas na polyphenol content. Gayunpaman, dahil sa mataas na phenolic content nito, ang ganitong uri ng apple juice ay partikular na madaling kapitan ng pagkawalan ng kulay at pagdidilim.9Iba't ibang teknolohiya, kabilang ang mga pamamaraan ng paggamot sa init tulad ng pasteurization sa 60–90°C, ay ginagamit upang mabawasan o maiwasan ang pagdidilim ng katas ng mansanas.10Gayunpaman, ayon sa pananaliksik ni Sauceda-Gálvez11, ang thermal processing ay maaaring makasira ng mga pabagu-bagong kemikal at makaapekto sa organoleptic na katangian ng apple juice. Ang mga alternatibo sa mga pamamaraan ng thermal processing ay kinabibilangan ng supercritical carbon dioxide, ultraviolet radiation, ultrasound, high hydrostatic pressure, o high-pressure homogenization.12Ang kahusayan ng mga teknolohiyang ito at ang ani ng angkop na mga katas ng prutas ay nakasalalay sa mga parametrong ginamit at mga katangian ng produkto. Ang malawakang paggamit ng mga ito ay limitado ng mataas na gastos, masamang epekto sa kalidad ng ilang produktong pagkain, o hindi sapat na pag-inaktibo ng enzyme.13,14
Maaaring gamitin ang Laccase upang patatagin at linawin ang katas ng prutas.15Gökmen at iba pa.16Inirerekomenda ang paggamit ng laccase para sa paglilinaw ng katas ng prutas dahil epektibo nitong inaalis ang mga phenolic compound sa pamamagitan ng pag-convert sa mga ito sa mga polymer o oligomer na madaling matanggal ng anumang ultrafiltration membrane, na nagpapahintulot sa katas ng mansanas na mapanatili ang matatag na kulay at kalinawan nang hanggang anim na linggo sa 50°C. Ang pinadalisay na *Trichoderma* laccase ay hindi nakilos sa mga alumina beads at ginamit upang piliing alisin ang mga compound na may kakaibang lasa na dulot ng kontaminasyon ng mikrobyo sa katas ng mansanas.17
Humigit-kumulang 80-90% ng mga pabagu-bagong sangkap ng katas ng mansanas ay mga ester at aldehyde, na nagbibigay ng kakaibang aroma sa katas.18Ang Laccase mula sa *Trametes versicolor* ay itinali sa isang murang suporta na gawa sa natural na hibla mula sa mga batang bao ng niyog para sa paglilinaw ng katas ng mansanas.19Sinuri ng mga nakaraang pag-aaral ang pagpapanatag ng katas ng mansanas (kulay at turbidity) gamit ang mga pamamaraang walang enzyme o immobilization, o kasama ng ultrafiltration.5,19Gayunpaman, ang epekto ng mga fungal laccase sa mga katangiang pisiko-kemikal ng katas ng mansanas habang iniimbak ay nananatiling hindi malinaw. Samakatuwid, ang layunin ng pag-aaral na ito ay upang eksperimentong siyasatin ang mga pagbabago sa mga katangiang pisiko-kemikal, nilalaman ng phenolic compound, at antioxidant activity ng katas ng mansanas pagkatapos ng paggamot gamit ang mga fungal laccase at dalawang linggong pag-iimbak sa refrigerator. Ang mga laccase ay may kakayahang mag-oxidize ng mga phenolic compound, na nagbibigay sa kanila ng magandang resulta para sa paggamit sa iba't ibang prosesong pang-industriya, kabilang ang paglilinaw ng katas. Sinuri ng pag-aaral na ito ang mga laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620, na nakatuon sa mga ideal na kondisyon para sa kanilang aktibidad at pagiging epektibo sa paglilinaw ng katas. Bagama't limitado pa rin ang pananaliksik sa mga oyster mushroom (P. ostreatus NRC 620), sinuri ng mga nakaraang pag-aaral ang mga enzyme mula sa iba't ibang pinagmumulan ng fungal, tulad ng Trametes versicolor at Ganoderma lucidum. Ang layunin ng pag-aaral na ito ay upang suriin ang potensyal na aplikasyon ng enzyme na ito sa industriya ng pagkain at i-highlight ang mga natatanging katangian nito, lalo na ang ideal na pH at temperatura nito.
Ang 2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) ay binili mula sa Sigma-Aldrich (Canada). Ang lahat ng iba pang reagent ay nasa analytical grade.
Nakuha ng Microbial Culture Collection Center ng National Research Center ang kilalang strain ng oyster mushroom na NRC620. Pagkatapos ng subculture, ang strain na ito ay itinago sa potato dextrose agar slants sa 4°C. Ang paraan ng paghahanda ng inoculum ay ang mga sumusunod: Ang 10-araw na gulang, ganap na nabuo na mycelium ay itinanim sa mga plate ng potato dextrose agar at in-incubate sa 28°C. Pagkatapos ng 10 araw, tatlong 12-mm-diameter na mycelial block ang tinanggal mula sa agar media gamit ang isang sterile metal punch at inilagay sa 250-mL na Erlenmeyer flasks na may cotton plugs na naglalaman ng 50 mL ng isterilisadong culture medium (pH 5.0, gaya ng inilarawan dati nina Othman et al.20). Ang mga kultura ay in-incubate sa 28°C sa loob ng 18 araw. Pagkatapos ay sinala ang mga kultura gamit ang Whatman No. 1 filter paper, at ang nagresultang supernatant ang nagsilbing pinagmumulan ng enzyme.
Ang aktibidad ng Laccase ay natukoy gamit ang ABTS bilang substrate. Ang reaction mixture (2 mL) ay naglalaman ng 500 μL ng 0.3 mM ABTS (natunaw sa 0.1 M sodium citrate buffer, pH 4.5) at ang kinakailangang dami ng enzyme sample na hinaluan ng distilled water.21,22Kung isasaalang-alang na ang laccase ay maaaring mag-oxidize ng ABTS sa temperatura ng silid (28 °C ± 2), ang oksihenasyon ng ABTS ay natukoy sa pamamagitan ng pagsukat ng pagtaas ng absorbance sa 420 nm (ε420= 36,000 sentimetro-1 M -1) gamit ang isang Agilent Carry-100 UV spectrophotometer. Isang unit ng laccase activity ang kinakailangan upang ma-oxidize ang 1 μmol ABTS kada minuto. Ang konsentrasyon ng protina ay natukoy gamit ang Bradford method gamit ang bovine serum albumin bilang internal control.23,24
Matapos makuha ang enzyme mula sa strain ng oyster mushroom na NRC 620, ang aktibidad nito ay sinukat sa iba't ibang pagitan ng paglilinang sa loob ng 25 araw sa ilalim ng mga static na kondisyon sa 28 °C.
Upang pag-aralan ang epekto ng temperatura sa aktibidad ng laccase, isinagawa ang mga eksperimento sa hanay ng temperatura mula 20 hanggang 90 °C. Bago idagdag ang enzyme at simulan ang reaksyon, ang buffer (0.1 M sodium citrate, pH 4.5) at substrate (ABTS) ay hinalo at in-incubate sa loob ng 5 minuto sa iba't ibang temperatura. Ang thermal stability ng enzyme ay tinasa sa pamamagitan ng incubation sa 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) sa 40, 50, 60, at 70 °C sa loob ng 2 oras, ayon sa pagkakabanggit. Ang natitirang aktibidad ay tinasa gamit ang ABTS substrate.
Ang epekto ng pH sa aktibidad ng laccase ay tinasa gamit ang ABTS bilang substrate sa 0.1 M citrate-phosphate buffers na may pH range na 2.5 hanggang 7.0. Ang enzyme solution ay in-incubate sa 40°C sa loob ng dalawang oras sa 0.1 M citrate at Tris buffers (pH 3, 4, 6, at 7) upang masuri ang pH stability. Ang residual activity gamit ang ABTS bilang substrate ay kinalkula pagkatapos ng incubation.
Ang laccase ay in-incubate sa loob ng 10 minuto sa sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) na naglalaman ng iba't ibang metal ions (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, at Mn2+) sa mga konsentrasyon na 2.5 mM at 10 mM, ayon sa pagkakabanggit. Ang substrate (ABTS) ay idinagdag upang simulan ang reaksyon, at tinasa ang relatibong aktibidad.
Ang oksihenasyon ng ABTS sa pamamagitan ng laccase sa iba't ibang konsentrasyon (0.025–3 mM) ay sinukat sa pH 4.5 upang matukoy ang mga kinetic parameter (Vmax at Km). Ang kineticmga konstanteng ekwasyon ni Michaelis-Menten ay kinalkula gamit ang isang Lineweaver-Burk plot, na nagpi-plot ng resiprokal ng rate ng reaksyon bilang isang function ng konsentrasyon ng substrate. Ang mga kinetic constant ay kinalkula mula sa Lineweaver-Burk plot gamit ang GraphPad Prism bersyon 6.01 software.
Matapos hugasan nang mabuti ang mga mansanas gamit ang tubig mula sa gripo, hiniwa ang mga ito sa kalahati at kinuhaan ng katas gamit ang isang ganap na awtomatikong Braun MP80 apple juicer (gawa sa Germany). Sinala ang katas gamit ang apat na patong ng cheesecloth. Walang idinagdag na enzyme sa control group, habang ang 2.0% laccase (ang pinakamabisang konsentrasyon na nasubukan) ay idinagdag sa bagong lutong katas ng mansanas, na pagkatapos ay iniimbak sa 4°C sa loob ng dalawang linggo.
Ang titratable acidity (TA) at pH ay natukoy ayon sa pamamaraan nina Boulton et al.al.27Ang pH ng bawat sample ay sinukat gamit ang isang digital pH meter (JENWAY 3510 pH meter). Ang titratable acidity (TA) ay kinalkula batay sa malic acid gamit ang sumusunod na pormula.
Kung saan ang V at C ay ang volume (mL) at concentration (0.1 mol/L) ng sodium hydroxide solution na ginamit sa titration, ayon sa pagkakabanggit. Ang K ay ang malic acid conversion coefficient, katumbas ng 0.067, at ang W ay ang mass (g) ng apple juice.
Ang kabuuang natutunaw na solido (TDS) ang nilalaman ng lahat ng sample ng juice ay natukoy gamit ang isang PAL-1 pocket refractometer (ATAGO, Tokyo, Japan). Pagkatapos ng bawat pagsukat, ang optical lens ay hinugasan ng deionized na tubig, at ang bawat sample ng apple juice ay sinubukan nang tatlong beses. Ang halaga para sa bawat sample ay kinalkula sa pamamagitan ng pag-average ng tatlong sukat. Ang mean ± standard deviation para sa bawat sample ng apple juice ay kinalkula rin sa pamamagitan ng pag-average ng mga resultang ito.
Ang viscoelasticity ng mga sample ng apple juice ay tinasa gamit ang isang rotational viscometer (RV, Rheotest 2, Germany). Ang sample ay inilagay sa loob ng “S2″ cylinder ng viscometer. Ang apparent viscosity ay kinakatawan ng slope ng shear stress versus shear rate curve, na kinalkula mula sa shear stress at mga kaukulang curve sa iba't ibang shear rate (mula 1.00 hanggang 437.4 s⁻¹). Ang pormula para sa pagkalkula ng apparent viscosity ay ang mga sumusunod:
Kung saan ang η ay ang maliwanag na lagkit (cP), ang τ ay ang shear stress (dyn/cm²), ang γ ay ang shear rate (sec⁻¹), at ang (τ) ay kinakalkula gamit ang mga halaga ng torque (α) at cylinder (Z) gamit ang sumusunod na pormula: τ = Z. α.
Ang browning index ay natukoy ayon sa pamamaraan ng Meidav etal.29Isang 10-ml na sample ng katas ang isinailalim sa centrifuge sa 2750 xg sa loob ng 10 minuto. 5 ml ng juice supernatant ang hinaluan ng 5 ml ng 95% ethanol. Ang absorbance ng timpla ay sinukat sa 420 nm gamit ang isang Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC).
Ang kabuuang phenolic content (TPC) ay natukoy sa pamamagitan ng kolorimetrikong paraan gamit ang Folin-Ciocalteu reagent gaya ng inilarawan nina Boulton et al.[27]Isang karaniwang kurba ng gallic acid ang ginawa para sa mga konsentrasyon mula 0 hanggang 500 mg/L (r²= 0.997). Ang mga resulta ay ipinapahayag bilang katumbas ng gallic acid (mg GAE/mL).
Magdagdag ng 125 μL ng distilled water at 2850 μL ng FRAP solution sa 25 μL ng apple juice at iwanan ang timpla sa dilim nang30min. Pagkatapos ay sukatin ang absorbance sa 593 nm gamit ang isang Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC). Ang FRAP reagent ay inihanda sa pamamagitan ng paghahalo ng 300 mM acetate buffer (pH 3.6), 20 mM iron(III) chloride, at 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazine (TPTZ) (natunaw sa 40 mM HCl) sa ratio na 10:1:1. Isang standard curve ang nabuo gamit ang Trolox bilang standard (R²= 0.999), at ang mga resulta ay ipinapahayag bilang μM Trolox/mL.
Ang aktibidad na antioxidant ng mga ginamot at hindi ginamot na katas ay natukoy gamit ang pamamaraang DPPH upang masuri ang kanilang kakayahang sumipsip ng mga free radical ng DPPH.31Sampung microliters ng juice ang hinaluan ng 1 ml ng DPPH solution (100 μM) sa methanol. Pagkatapos ng reaksyon sa dilim sa loob ng 30 minuto, ang absorbance ng mixture ay sinukat sa 517 nm gamit ang Shimadzu UV spectrophotometer (UV-1601 PC). Ang mga resulta ay ipinahayag bilang trolox equivalents (μM trolox/ml) batay sa isang calibration curve (R2= 0.990).
Ang datos na nakuha ay nagpakita na ang pinakamataas na produksiyon ng laccase ay naobserbahan sa mga kabute ng talaba ng NRC 620 sa pagtatapos ng ika-18 araw ng permentasyon, na umabot sa aktibidad na 1302 U/L. Ito ang nagsilbing batayan para sa pagtukoy ng pinakamainam na oras ng paglilinang para sa produksiyon ng laccase (Larawan 1). Bagama't tumaas ang produksiyon ng enzyme kasabay ng pagtaas ng oras ng paglilinang, ang rate ng pagtaas ay hindi direktang proporsyonal sa oras ng paglilinang; pagkatapos ng 21 araw, ang aktibidad ng enzyme ay tumaas lamang ng 90 U/L (hanggang 1390 U/L). Samakatuwid, 18 araw ang napili bilang pinakamainam na oras ng paglilinang upang balansehin ang ani ng produkto sa mga benepisyong pang-ekonomiya ng mas mahabang oras ng paglilinang.
Epekto ng oras ng paglilinang sa ani ng laccase sa Pleurotus ostreatus NRC 620. Tatlong (12 mm) na fungal mycelial blocks ang itinanim sa 50 ml ng sterile medium at pagkatapos ay kinultura sa 28 °C sa iba't ibang oras.
Alinsunod sa iba pang mga pag-aaral, ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang mainam na panahon ng paglilinang upang makamit ang pinakamataas na pagtatago ng laccase ng fungi ay malamang na nasa pagitan ng 7 at 36 na araw.32Ayon kina Ezike et al.33, *Trametes polyzona* Ang WRF03 ang nakagawa ng pinakamataas na dami ng laccase sa pagtatapos ng ikasiyam na araw ng permentasyon, na may partikular na aktibidad na 1637 U/mg na protina. Bukod pa rito, sina Othman et al.34natuklasan na ang *Trichoderma harzianum* S7113 ay naglabas ng malaking dami ng laccase sa ikalimang araw ng pag-aalaga. Ang antas ng produksyon ng laccase ay umabot sa pinakamataas na aktibidad sa ikalabing-apat na araw at pagkatapos ay unti-unting bumaba.34Bagama't maaari ring mangyari ang pagtatago ng enzyme sa pangunahing yugto ng paglaki, kadalasan itong tumataas sa pinakamataas na antas sa gitnang yugto at napupukaw ng pagkonsumo ng pinagmumulan ng carbon o nitrogen.34,35
Bagama't ang laccase mula sa Pleurotus ostreatus NRC 620 ay nagpakita ng mataas na aktibidad sa malawak na saklaw ng temperatura mula 50°C hanggang 80°C, na malapit sa tugatog na aktibidad (69–98%), ang pinakamataas na aktibidad nito ay naobserbahan sa 70°C (Fig. 2a). Sa labas ng saklaw ng temperaturang ito, ang aktibidad ng enzyme ay bumaba sa humigit-kumulang 70°C. Ang mga resultang ito ay nagmumungkahi na ang enzyme ay aktibo sa mataas na temperatura, malamang dahil ang mataas na temperatura ay nagpapataas ng kinetic energy ng reaksyon.
Epekto ng temperatura ng reaksyon (a) at pH (b) sa aktibidad ng laccase sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Ang mga temperaturang mula 20 hanggang 90 °C ay nakamit sa pamamagitan ng paunang pag-incubate ng halo sa iba't ibang temperatura sa loob ng 5 minuto bago idagdag ang enzyme at simulan ang reaksyon. Ang epekto ng pH sa aktibidad ng laccase ay tinasa gamit ang ABTS bilang substrate sa mga solusyon na naglalaman ng 0.1 M citrate-phosphate buffer sa hanay ng pH na 2.5 hanggang 7.0.
Ayon kay Ezike etal.33, ang pinakamainam na temperatura para sa *Trametes polyzona* WRF03 laccase ay 55 °C, na kapareho ng sa *Ganoderma lucidum*laccase36at katulad ng pinakamainam na temperatura (50 °C) para sa *Trametes polyzona* KU-RNW02737laccase . Baldrian38binabanggit na, tulad ng para sa iba pang mga sistema ng enzyme na nagpapababa ng lignin, ang mainam na saklaw ng temperatura para sa laccase ay nasa pagitan ng 50 at 70 °C.
Ipinakita ng mga resulta na ang enzyme ay nagpakita ng pinakamataas na aktibidad sa pH 3.0, na umabot sa 94% na aktibidad sa pH 3.5. Gayunpaman, nanatili itong aktibo sa malawak na hanay ng pH mula 2.5 hanggang 7.0 (Larawan 2b). Bukod pa rito, nagpakita ito ng mas mataas na aktibidad sa mga kondisyong acidic kumpara sa mga kondisyong neutral o alkaline. Ang aktibidad nito ay nanatiling hindi bababa sa 77% sa hanay ng pH mula 2.5 hanggang 4.5, ngunit umabot lamang sa humigit-kumulang 38% sa pH 7.0. Ang pinakamainam na pH para sa laccase mula sa *Trametes polyzona* WRF03 ay 4.533, na kapareho ng pH para sa mga laccase mula sa *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, at *Trametes hirsuta* 41. Gayunpaman, ayon sa pag-aaral nina Chairin et al.42, ang pinakamainam na pH para sa laccase mula sa *Polymorpha f. sp.* WR710-1 ay 2.2, habang ang pinakamainam na pH para sa laccase mula sa *Polymorpha f. sp.* IBL-04 ay 5.043. Ang pagbubuklod ng mga hydroxide anion (laccase inhibitor) sa mga copper atom ng T2/T3 laccase ay maaaring ang dahilan ng pagbaba ng aktibidad ng laccase sa ilalim ng neutral o alkaline na mga kondisyon ng pH. Maaari nitong maantala ang internal electron transfer mula sa T1 center patungo sa T2/T3 center, sa gayonnaglilimitaang aktibidad ng enzyme23,44
Sa pamamagitan ng pag-incubate ng enzyme sa iba't ibang temperatura, natuklasan na ang parehong oras at temperatura ng incubation ay nakaapekto sa katatagan ng enzyme. Kapansin-pansin, ang laccase mula sa *Trametes polyzona* NRC 620 ay nagpakita ng mas mataas na katatagan sa 40℃ at 50℃, na nagpapanatili ng 68.33% at 59.61% ng paunang aktibidad nito, ayon sa pagkakabanggit, pagkatapos ng 120 minuto (Larawan 3a). Sa kabaligtaran, sa ilalim ng parehong mga kondisyon (40℃ at 50℃, 120 minuto), ang laccase mula sa *Trametes polyzona* WRF03 ay nagpapanatili ng 64.38% at 42.92% ng aktibidad nito, ayon sa pagkakabanggit.33Sa kabaligtaran, ang pagtaas ng oras at temperatura ng inkubasyon ay nagpababa sa katatagan ng *Trametes polyzona* NRC 620 laccase; Pagkatapos ng inkubasyon sa 60℃ at 70℃ sa loob ng 60 minuto, ang aktibidad nito ay bumaba sa 39.24% at 1.72%, ayon sa pagkakabanggit (Larawan 3a). Alinsunod sa mga resulta ng eksperimento, ang laccase mula sa *Trametes polyzona* WRF03 ay nagpakita ng mas mataas na katatagan sa 40 at 50℃ sa buong proseso ng thermal treatment.33Gayundin, si Lueangjaroenkit etal.37at Chairin et al.al.42iniulat ang katatagan ng mga laccase mula sa Trametes polyzona KURNW027 at Trametes polyzona WR710-1 sa 50 °C sa loob ng 1 oras, ayon sa pagkakabanggit. Bilang isang kapaki-pakinabang na biocatalyst na naaangkop sa iba't ibang larangan ng bioteknolohiya, ang laccase ay dapat magkaroon ng mahusay na katatagan at pagganap sa isang malawak na saklaw ng temperatura.
Estabilidad na termostatiko (a) at estabilidad na pH (b) ng laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Ang estabilidad na termostatiko ay tinasa sa pamamagitan ng pag-incubate ng solusyon ng enzyme sa 0.05 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) sa 40, 50, 60, at 70 °C sa loob ng 2 oras, ayon sa pagkakabanggit. Ang estabilidad na pH ay tinasa sa pamamagitan ng pag-incubate ng solusyon ng enzyme sa 0.1 M citrate buffer at Tris buffer (pH 3, 4, 6, at 7) sa 40 °C sa loob ng 2 oras. Ang natitirang aktibidad ay kinalkula gamit ang ABTS bilang substrate pagkatapos ng incubation.
Upang matukoy ang pinakamainam na mga kondisyon para sa paggamit at pag-iimbak ng enzyme, sinuri namin ang epekto ng pH sa katatagan ng laccase. Ang pagkakalantad sa iba't ibang halaga ng pH ay makabuluhang nakaapekto sa katatagan ng istruktura ng protina, sa gayon ay nakakaimpluwensya sa katatagan at aktibidad ng molekula ng enzyme. Ipinakita ng mga resulta na ang enzyme ay hindi gaanong matatag sa ilalim ng mga kondisyon ng acidic, habang nagpakita ito ng mas mahusay na katatagan sa mas mataas na halaga ng pH (mga neutral at alkaline na rehiyon). Sa mga halaga ng pH na 7.0, 6.0, 4.0, at 3.0, ang mga rate ng pagpapanatili ng enzyme pagkatapos ng 120 minuto ay humigit-kumulang 100%, 62.54%, 52.39%, at 11.14%, ayon sa pagkakabanggit (Fig. 3b). Ang *Strombus multisus* WRF03 laccase ay nagpakita ng mas mataas na katatagan sa mga neutral na halaga ng pH (5.5–6.5) at mas mababang katatagan sa mga acidic na halaga ng pH (mas mababa sa 4.0). Pagkatapos ng 120 minuto sa mga halaga ng pH na 5.5, 6.0, at 6.5, ang mga rate ng pagpapanatili ng enzyme ay humigit-kumulang 82%, 100%, at 93%, ayon sa pagkakabanggit.33Khairin at iba pa.42nabanggit na ang laccase mula sa Trametes polyzona WR710-1 ay matatag sa hanay ng pH na 6.0 hanggang 7.0, habang si Sayed et al.45Ipinakita ng laccase na mas matatag sa ilalim ng mga neutral na kondisyon ng pH. Gayunpaman, ang laccase mula sa Cerrena unicolor ay nagpakita rin ng katatagan sa ilalim ng mga kondisyon ng alkalina (pH 9.0)46Ang mga laccase na pinag-aralan ay nagpakita ng mataas na estabilidad sa malawak na hanay ng pH. Maaaring ito ay isang mahalagang katangian para sa mga aplikasyong pang-industriya.
Dahil ang ilang metal ions ay may parehong stimulatory at inhibitory effect sa aktibidad ng enzyme, ang kanilang mga epekto sa aktibidad ng enzyme ay dapat isaalang-alang sa mga aplikasyong pang-industriya. Mahalaga ito dahil ang mga metal ions ay karaniwang mga kontaminante sa kapaligiran na maaaring makaapekto sa katatagan at sintesis ng mga extracellular enzymes.47Upang siyasatin ang mga epekto ng maraming metal ions sa laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620, nagsagawa kami ng mga kaukulang eksperimento. Gaya ng ipinapakita sa Figure 4, depende sa uri ng metal na ginamit, ang pagtaas ng konsentrasyon ng metal ion mula 2.5 mM hanggang 10 mM ay negatibong nakaapekto sa tungkulin ng enzyme. Halimbawa,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, atCu²⁺maaaring magpasigla at mag-activate ng aktibidad ng enzyme, habangNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, atK⁺maaaring pumigil sa aktibidad ng enzyme. Sa konsentrasyon na 10 mM, ang mga Cu²⁺ at Mg²⁺ ion ang pinakamalakas na activator ng aktibidad ng laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620, na nagbibigay ng antas ng activation na humigit-kumulang 34% at 20%, ayon sa pagkakabanggit. Gayunpaman, sa konsentrasyon na 10 mM, ang mga Ca²⁺ ion ang pinakamalakas na inhibitor ng laccase, na binabawasan ang aktibidad ng enzyme ng humigit-kumulang 60%.
Ang epekto ng mga metal ion sa aktibidad ng Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase. Ang laccase ay in-incubate sa loob ng 10 minuto sa sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.0) na naglalaman ng iba't ibang metal ion sa konsentrasyon na 2.5 mM at 10 mM. Ang reaksyon ay sinimulan sa pamamagitan ng pagdaragdag ng substrate (ABTS), pagkatapos nito ay sinukat ang relatibong aktibidad.
Ang aming mga resulta ay naaayon sa mga resulta ng ibang mga may-akda na natuklasan na ang Mg²⁺ at Cu²⁺ ay nagpapahusay sa aktibidad ng *Trametes polyzona* WRF03³. Natuklasan nina Castaño et al.⁴⁸ na ang laccase mula sa *Xylaria* sp. ay pinasisigla sa ilang antas ng mga copper ion (Cu²⁺). Bukod dito, sina Foroutanfar et al.⁴⁹ at Si et al.⁵⁰ ay nagsagawa ng mga katulad na pag-aaral sa mga laccase mula sa *Paraconiothyrium variabile* at *Trametes pubescens*, ayon sa pagkakabanggit. Ang type II copper-binding site (T2) ng enzyme na ito ay maaaring puspusan ng Cu²⁺ sa isang partikular na konsentrasyon, na maaaring magpaliwanag sa pagpapasigla ng aktibidad ng laccase sa mas mataas na konsentrasyon ng Cu²⁺³⁹. Dahil ang mga laccase ng white rot fungi ay mga oxidase na naglalaman ng maraming atomo ng tanso, ang mga epekto ng mga ion ng tanso sa aktibidad ng laccase ay iba-iba at mula sa stimulatory at inhibitory hanggang sa neutral.⁵¹ Sa kabaligtaran, si Zhou et al.. [52]iniulat naCu²⁺pinigilan ang aktibidad ng laccase ng anay sa ilalim ng lupa ng Taiwan (Odontotermes formosanus). Gayunpaman, ang mga laccase ng Cerena sp. HYB07[53]at Clitocybe maxima[54]ay hindi naapektuhan ng mga copper ion.
Ang ispesipisidad ng substrate ay kinakatawan ng mga kinetic parameter nito (Km at Vmax); mas malakas ang binding affinity ng substrate sa enzyme, mas mababa ang halaga ng Km at mas mataas ang ispesipisidad ng substrate.3,21,55Ang mga kinetic parameter (Km at Vmax) ng laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ay natukoy gamit ang GraphPad Prism 6.0 software sa pamamagitan ng pag-plot ng Lineweaver-Burk plot (Larawan 5). Kapag ginamit ang ABTS bilang substrate, ang mga resulta ay 1.99 mM at 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,ayon sa pagkakabanggit. Elsayed et al.21iniulat na ang mga halaga ng Km para sa oksihenasyon ng ABTS ay 0.1 mM at 0.064 mM, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig ng mataas na affinity ng Lac A at Lac B isoenzymes para sa ABTS. Bukod pa rito, ang mga halaga ng Vmax ay 0.182 μmolmin⁻¹at 0.603 μmolmin⁻¹, ayon sa pagkakabanggit. Ang nakuha na halaga ng Km ay mas mababa kaysa sa Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); bukod pa rito, ang kanilang halaga ng Vmax (1429 mmol min⁻¹) aymas mababakapag ginagamit ang ABTS bilang substrate.33 Gayundin, ang mga halaga ng Km ng Lentinus squarrosulus MR13 at Trametes sp. AH28-2 laccase concentrations ay 0.0714 mM at 0.025 mM, ayon sa pagkakabanggit, at ang mga halaga ng Vmax ay 0.0091 mM min−1 at 0.67 mM min−1 mg−1 (kumpara sa ABTS), ayon sa pagkakabanggit.56,57
Sinuri ang epekto ng konsentrasyon ng ABTS sa aktibidad ng laccase mula sa *Pleurotus ostreatus* NRC 620, at isang Lineweaver-Burk plot ng resiprokal ng paunang bilis ng reaksyon laban sa konsentrasyon ng ABTS ang ipinlot. Ang reaksyon ng oksihenasyon ng ABTS na may iba't ibang konsentrasyon (0.025–3.0 mM) ng laccase ay sinukat sa pH 4.5 upang matukoy ang mga kinetic parameter (Vmax at Km). Ang mga Michaelis-Menten kinetic constant ay kinalkula gamit ang Lineweaver-Burk plot ng resiprokal ng bilis ng reaksyon laban sa konsentrasyon ng substrate. Ang mga kinetic constant ay kinalkula mula sa Lineweaver-Burk plot gamit ang GraphPad Prism 6.01 software.
Ang mga tradisyonal na clarifying enzyme, tulad ng mga pectinase, ay nagha-hydrolyze ng mga pectic substance, na binabawasan ang lagkit at turbidity. Epektibo nilang sinisira ang mga structural polysaccharide at kadalasang ginagamit kasama ng iba pang mga enzyme, tulad ng mga cellulase at hemicellulase, upang mapabuti ang ani at kalinawan. Gayunpaman, ang mga pectinase ay hindi partikular na nagta-target sa mga phenolic compound, na siyang pangunahing nag-aambag sa turbidity at oxidative browning, lalo na sa mga juice tulad ng apple at grape juice.58Sa kabaligtaran, ang mga laccase ay nagpapabilis sa oksihenasyon ng mga phenolic compound, na ginagawang polimerisado ang mga ito upang maging mas malalaki at hindi matutunaw na mga molekula na maaaring alisin sa pamamagitan ng sedimentation o filtration. Ang mekanismong ito ay hindi lamang nagpapabuti sa kalinawan kundi nagpapahaba rin sa shelf life ng juice sa pamamagitan ng pagbabawas ng posibilidad ng oxidative browning na dulot ng mga phenolic compound. Bukod pa rito, ang mga proseso ng clarification na nakabatay sa laccase ay maaaring isagawa sa ilalim ng banayad na mga kondisyon ng pagproseso (pH 3.5–5.5, temperatura 25–40 °C), na ginagawa itong angkop para sa mga delikadong juice nang hindi nakompromiso ang kanilang mga nutritional o organoleptic na katangian.59Ipinakita ng mga pag-aaral na ang paggamot gamit ang pectinase ay kayang linawin ang katas sa loob ng 1-2 oras, habang ang paggamot gamit ang laccase ay karaniwang nangangailangan ng mas mahabang oras ng reaksyon (3-6 na oras) upang ganap na mabawasan ang mga phenolic compound. Gayunpaman, ang prosesong ito ay maaaring ma-optimize sa pamamagitan ng pag-immobilize ng enzyme o sa pamamagitan ng pagsasama ng laccase sa mga mekanikal na pamamaraan ng paglilinaw.60Sa pag-aaral na ito, ang enzyme profiling ng krudong katas ay nagpakita ng makabuluhang aktibidad ng laccase at α-amylase, habang ang aktibidad ng pectinase at xylanase ay napakababa, at ang aktibidad ng cellulase ay hindi natukoy. Samakatuwid, ang pagbaba ng turbidity at phenolic content ay pangunahing dahil sa aksyon ng laccase, habang ang pagbabago sa lagkit ay maaaring bahagyang dahil sa aksyon ng amylase.
Ipinapakita ng Talahanayan 1 ang mga parametrong pisiko-kemikal ng mga bagong pigang katas ng mansanas at mga sample na ginamot gamit ang laccase. Ipinakita ng mga resulta na ang ani ng bagong pigang katas ng mansanas (71.59%) ay mas mababa kaysa sa mga sample na ginamot gamit ang laccase (87.34%). Ang mga resultang ito ay naaayon sa mga natuklasan nina Pilnik at Orange.61, na nagpahiwatig na ang paggamit ng mga enzyme sa pagproseso ng prutas ay maaaring magpataas ng ani ng katas, mapabuti ang pagsasala, at makakuha ng mataas na kalidad at malinaw na katas para sa konsentrasyon. Ang pagtaas ng ani ng katas ay pangunahing dahil sa pagtaas ng nilalaman ng mga natutunaw na asukal sa katas. Sa panahon ng enzymatic hydrolysis ng mga prutas, ang mesoglea at pectin sa mga cell wall ng produkto ay nasisira at nababago sa mga natutunaw na sangkap tulad ng mga neutral na asukal at acid.62.Ang halaga ng pH ng katas ng mansanas na ginamot gamit ang enzyme ay mas mababa nang malaki kaysa sa control group (P < 0.05), at ang halaga ng pH ng parehong grupo ay tumaas nang malaki habang iniimbak (Talahanayan 1). Ang mga resultang ito ay naaayon sa mga kina Mark et al.63, na nagsabing ang pH ng katas ng kasoy ay bumaba pagkatapos ng pag-iimbak pagkatapos ng heat treatment. Ang pagkasira ng pectin at pagbuo ng galacturonic acid pagkatapos ng enzyme treatment ay maaaring responsable sa pagtaas ng pH habang iniimbak. Ang pH ng mga sample na ginamot gamit ang enzyme ay nanatili sa pagitan ng 4.05 at 4.31 sa buong pag-iimbak, habang ang pH ng hindi ginamot na katas ng mansanas ay nasa pagitan ng 4.12 at 4.33.
Ang kabuuang kaasiman (TA) ng parehong mga sample na hindi ginamot at hindi ginamot gamit ang laccase ay nagpakita ng pagbaba ng trend kasabay ng pagtaas ng oras ng pag-iimbak (Talahanayan 1). Ang pagbaba ng kaasiman ay maiuugnay sa conversion ng mga organic acid sa carbohydrates o enzymatic reactions, pati na rin sa oksihenasyon habang iniimbak ang juice.64Ang kabuuang kaasiman ng control apple juice at mga sample na ginamot gamit ang enzyme ay mas mababa kaysa sa ibang mga juice (strawberry juice 0.9%, plum juice 2.2%, kumquat juice 1.0%, apricot juice 2.4%, orange juice 0.8%), ngunit katulad ng sa ibang mga juice (hal., peras juice 0.3%).62Ang mga pagkakaibang ito sa hindi ginagamot na sariwang pinigang katas ng mansanas ay maaaring dahil sa iba't ibang salik tulad ng mga kondisyon ng paglaki, mga salik na henetiko, antas ng pagkahinog, at mga pamamaraan sa pagproseso.65Ang pagbaba ng kabuuang kaasiman ng katas ng mansanas na ginamot gamit ang kontrol at laccase ay naaayon sa mga resultang ipinakita nina Singh et al.66hinggil sa pagbaba ng kabuuang kaasiman ng katas ng mansanas na Jin Nuo pagkatapos ng 74 na araw na pag-iimbak. Sa kabilang banda, sina Oshmiansky at Wojdylo67walang nakitang anumang makabuluhang pagbabago sa kaasiman ng katas ng mansanas nang pag-aralan ang epekto ng mga tradisyonal na pamamaraan ng paglilinaw.
Ang mga resultang ipinakita sa Talahanayan 1 ay nagpapahiwatig na ang kabuuang soluble solids (TSS) na halaga ng apple juice na ginamot gamit ang laccase ay mas mataas kaysa sa sample na hindi ginamot. Ang mga resultang ito ay naaayon sa mga nailathalang pag-aaral..68Bukod pa rito, ipinapakita ng Talahanayan 1 na ang halaga ng TSS ng control apple juice group ay 9.58 sa unang punto ng oras at umabot sa 11.05 sa pagtatapos ng panahon ng pag-iimbak. Ang mga halagang ito ay mas mababa kaysa sa mga halaga ng TSS ng sariwang apple juice na iniulat nina Hamid et al..69(11.2 at 11.80, ayon sa pagkakabanggit). Ang halaga ng TSS ng mga sample ng apple juice na ginamot gamit ang laccase ay tumaas nang malaki, simula sa 11.23 at umabot sa 12.93 pagkatapos ng dalawang linggong pag-iimbak sa 4°C (Talahanayan 1). Isang katulad na pagtaas sa TSS habang iniimbak ang naobserbahan din sa mga citrus fruit, lemon, at sweet orange. Ang pagtaas sa total soluble solids (TSS) habang iniimbak ay maaaring dahil sa hydrolysis ng polysaccharides (starch) sa monosaccharides (asukal), ang pagtaas ng konsentrasyon dahil sa dehydration ng juice, at ang degradasyon ng pectin sa juice sa soluble solids. Ang pagtaas sa total soluble solids (TSS) ay malamang dahil sa pagtaas ng soluble sugars, na maaaring mabuo sa pamamagitan ng conversion ng pectin o cellulose sa soluble sugars sa pamamagitan ng pectin o cellulase, ayon sa pagkakabanggit, o sa pamamagitan ng hydrolysis ng starch sa sugars, gaya ng iniulat nina Hamed et al.69.Ang epekto ng laccase sa mga katangian ng katas ng mansanas ay maaaring maobserbahan nang biswal, dahil ang katas ng mansanas na ginamot gamit ang laccase ay nagpapakita ng mas mahusay na daloy at mas mababang lagkit kaysa sa katas na hindi ginamot. Ang obserbasyong ito ay nakatala sa Talahanayan 1; Ang lagkit ng sample na ginamot gamit ang enzyme ay 1.87 cP, habang ang lagkit ng control sample ay 2.95 cP. Ang makabuluhang pagbaba ng lagkit na ito ay malamang dahil sa mas mataas na kapasidad ng paghawak ng tubig ng mga sangkap na parang pectin at ang pagbuo ng isang magkakaugnay na istruktura ng network.
Sa pag-aaral na ito, sinuri ang epekto ng laccase sa browning index (BI) ng apple juice sa pamamagitan ng pagsukat ng absorbance sa 420 nm gamit ang isang spectrophotometer. Ang mga resulta ay ipinapakita sa Table 1. Sa panahon ng pag-iimbak, ang BI ng mga sample ng apple juice sa parehong ginamot at hindi ginamot na mga grupo ay nagpakita ng unti-unting pagtaas ng trend. Ang BI ay sumasalamin sa antas ng browning at maaaring magsilbingisang mahalagangindikasyon ng mga reaksiyong enzymatic at non-enzymatic browning. Ang absorbance ay tumaas nang malaki habang iniimbak (P < 0.05). Sa pagtatapos ng pag-iimbak, angA420Ang halaga ng mga sample ng apple juice sa mga control at enzyme-treated na grupo ay tumaas ng humigit-kumulang 217% at 121%, ayon sa pagkakabanggit (Talahanayan 1). Ipinapahiwatig ng mga resulta na ang enzyme treatment ay maaaring epektibong mabawasan ang browning degree ng humigit-kumulang 56%. Ang mga resulta nina Bezerra et al.[19]] ay naaayon sa aming mga resulta; Gumamit sila ng laccase-glutaraldehyde-coconut fiber upang linawin ang katas ng mansanas, na nagbawas sa orihinal na kulay nito ng 61%.
Bagama't ang mga polyphenol sa mga katas ng prutas ay may positibong epekto sa nutrisyon at therapeutic sa katawan ng tao, maaari rin itong makipag-ugnayan sa mga protina, na nagiging sanhi ng pagkaulap ng katas, sedimentation, o turbidity, sa gayon ay binabago ang lasa at aroma ng produkto at binabawasan ang shelf life nito.71Ang layunin ng pag-aaral na ito ay ligtas na mabawasan ang nilalaman ng phenolic compound ng apple juice gamit ang laccase mula sa Pleurotus ostreatus NRC 620. Ang mga resultang ipinakita sa Table 1 ay nagpapakita na ang kabuuang nilalaman ng phenolic compound ng apple juice na ginamot gamit ang laccase ay makabuluhang nabawasan bago ang pag-iimbak sa 4 °C. Bukod pa rito, ang kabuuang nilalaman ng phenolic compound ay bumaba rin habang iniimbak sa parehong sample na pinag-aralan (Table 1). Pananaliksik nina Sandri et al.72ipinakita na ang enzyme-treated apple juice ay maaaring mapanatili ang antioxidant activity at phenolic compound content nito. Gayunpaman, ang mga resulta ng isang pag-aaral nina Lettera et al.73Ipinapakita ng mga pag-aaral na ang paggamot ng orange juice gamit ang fungal laccase ay maaaring makabawas sa nilalaman ng mga phenolic compound dito nang hanggang 45%.
Ang mga phenolic compound ay naipakita na may mga katangian tulad ng free radical scavenging, singlet oxygen reduction at quenching, hydrogen atom transfer, at electron donation sa mga free radical, na ginagawa silang mabisang antioxidant.74Samakatuwid, sa pag-aaral na ito, ginamit ang mga pamamaraang nakabatay sa DPPH at FRAP upang suriin ang epekto ng laccase sa antioxidant activity ng apple juice na nakaimbak sa refrigerator sa loob ng 14 na araw (Talahanayan 2). Ang parehong pamamaraan ay nagpakita ng pagtaas sa antioxidant activity habang iniimbak, na maaaring dahil sa pagtaas ng mga libreng phenolic compound o ang pagbuo ng mga Maillard reaction product (MRP), kung saan ang mga Maillard reaction product ang malamang na sanhi ng pagtaas ng antioxidant activity.75Ang mga non-enzymatic browning reactions (kabilang ang ascorbic acid degradation, Maillard reactions, at acid-catalyzed degradation ng mga asukal) ay lumilikha ng mga brown pigment (melanoidins). Ang mga intermediate ascorbic acid degradation products at sugar degradation products (tulad ng mga carbonyl compound) ay maaaring mag-react sa mga amino acid sa pamamagitan ng Maillard reactions.76Bagama't malawakang pinag-aralan ang pagkulay-kayumanggi ng mga prutas at gulay habang iniimbak, nananatiling limitado ang ating pag-unawa sa mga reaksyong ito.77Kung ikukumpara sa pamamaraang FRAP, ang katas ng mansanas na ginamot gamit ang laccase ay nagpakita ng mas mababang aktibidad na antioxidant gamit ang pamamaraang DPPH (Talahanayan 2), at ang aktibidad na antioxidant ng lahat ng mga sample ay tumaas nang malaki kasabay ng pagtaas ng oras ng pag-iimbak. Dalawang magkaibang pamamaraan para sa pagtukoy ng aktibidad na antioxidant ang ginamit sa pag-aaral na ito dahil magkaiba ang kanilang mga prinsipyo. Sinusukat ng pamamaraang DPPH ang kakayahang i-neutralize ang mga free radical, habang sinusukat naman ng pamamaraang FRAP ang kakayahang bawasan ang mga iron ion. Samakatuwid, inirerekomenda na gumamit ng maraming pamamaraan para sa pagtukoy ng aktibidad na antioxidant upang mas maunawaan ang aktibidad na antioxidant ng mga sample na pinag-aralan.78
Isa sa mga pangunahing natuklasan sa pag-aaral na ito ay ang *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 ay nagpapakita ng pinakamainam na aktibidad sa 70°C at pH 3.0. Kung ikukumpara sa iba pang fungal laccases na karaniwang ginagamit para sa paglilinaw ng katas, tulad ng *Trametes versicolor* at *Ganoderma lucidum* laccases, ang *P. ostreatus* NRC 620 ay nagpapakita ng mas mataas na thermal stability at mas acidic na pH. Ang mga laccase mula sa *Trametes versicolor* at *Ganoderma lucidum* ay karaniwang nagpapakita ng pinakamainam na aktibidad sa hanay na 50-60°C at sa mga halaga ng pH sa pagitan ng 3.5 at 5.0. Ang pagkakaibang ito ay maaaring mag-ambag sa pinahusay na kahusayan sa paglilinaw ng katas, lalo na para sa mga acidic na katas kung saan ang katatagan sa mas mababang mga halaga ng pH ay kritikal. Ang natatanging katangian ng *P. Kung ikukumpara sa iba pang pinag-aralang fungal laccases, ang *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ay nagpapakita ng kakayahang gumana nang epektibo sa ilalim ng mas mapaghamong mga kondisyon. Ang mas mataas na pinakamainam na temperatura ng aktibidad nito ay nagmumungkahi ng mga potensyal na bentahe sa mga aplikasyong pang-industriya, tulad ng mas mabilis na mga rate ng reaksyon at nabawasang kontaminasyon ng mikrobyo. Ang mababang pH nito, na angkop sa acidic na katangian ng maraming juice, ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa mga proseso ng paglilinaw ng juice. Ang mga resultang ito ay nagbibigay-katwiran sa karagdagang paggalugad para sa malawakang aplikasyon, na ginagawang isang mabisang alternatibo ang *Pleurotus ostreatus* NRC 620 sa mga tradisyonal na pinagmumulan ng fungal laccase. Kung ikukumpara sa mga nakaraang pag-aaral, natuklasan namin na ang pinakamainam na temperatura ay 60°C at ang pinakamainam na pH ay 3.0. Pagkatapos ng reaksyon sa 60°C sa loob ng 80 minuto, napanatili ang *Ganoderma lucidum* laccase.46% ng aktibidad nito.79 Ayon kina Kurniawati at Nicelle80, ang mga enzyme ng *Ganoderma lucidum* ay nagpapakita ng mahusay hanggang katamtamang katatagan sa 25°C at mga halaga ng pH mula 5.0 hanggang 8.0, at katatagan sa pH 6.0 at mga temperatura mula 10 hanggang 30°C. Sa pag-aaral na ito, natuklasan namin na ang pinakamainam na pH at temperatura para sa aktibidad ng enzyme para sa *Pleurotus ostreatus* ay 3.0 at 70°C, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos ng inkubasyon sa 40°C at 50°C sa loob ng dalawang oras, napanatili ng enzyme ang 68.33% at 59.61% ng aktibidad nito, ayon sa pagkakabanggit. Bukod pa rito, ang Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase ay nagpakita ng mataas na aktibidad sa malawak na saklaw ng temperatura mula 50°C hanggang 80°C, halos umabot sa pinakamataas na aktibidad (69%–98%), na may pinakamataas na aktibidad na naobserbahan sa 70°C.
Bilang konklusyon, ang oyster mushroom laccase NRC620, na nakuha sa ilalim ng mga static na kondisyon, ay nagpakita ng pinakamainam na aktibidad at katatagan sa iba't ibang pH at kondisyon ng temperatura, na nagpapakita ng higit na mahusay na katatagan kumpara sa iba pang mga pinagmumulan ng enzyme. Ang pagdaragdag ng 10 mM MgSO₄ at CuSO₄ ay nagpataas ng aktibidad ng enzyme ng humigit-kumulang 21% at 35%, ayon sa pagkakabanggit. Nang iproseso sa apple juice, binawasan ng enzyme ang pH at lagkit, habang ang phenolic content ay bahagyang nabawasan lamang habang iniimbak.
Kinukumpirma ng mga resulta ang potensyal ng laccase sa industriya ng pagkain, lalo na sa paglilinaw ng inumin. Sa pamamagitan ng partikular na pagsira sa mga phenolic compound, hindi lamang binabawasan ng laccase ang turbidity at pinapabuti ang kalinawan kundi pinapanatili rin ang kalidad ng mga katas ng prutas sa ilalim ng banayad na mga kondisyon ng pagpapatakbo. Hindi tulad ng mga tradisyonal na clarifying agent tulad ng gelatin, bentonite, at silica gel, ang laccase ay hindi lumilikha ng basura o nag-aalis ng kaaya-ayang aroma mula sa mga inumin, kaya't ito ay isang mas environment-friendly at napapanatiling opsyon. Bukod pa rito, kumpara sa iba pang mga enzyme at pamamaraan ng pagsasala, ang laccase ay nag-aalok ng isang naka-target at cost-effective na solusyon nang hindi nakompromiso ang kalidad ng produkto.
Kyomuhimbo, HD at Brink, HG. Mga aplikasyon at estratehiya sa immobilisasyon ng mga laccase na naglalaman ng tanso; isang pagsusuri. Heliyon 9, e13156 (2023).
Oras ng pag-post: Disyembre 15, 2025